Что значит устойчивость и чувствительность к антибиотикам. Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам. Методы определения чувствительности к антибиотикам
Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существует ряд методов, среди которых наиболее распространены: метод последовательных разведений в жидкой питательной среде или питательном агаре, метод диффузии в агар (метод дисков, насыщенных антибиотиками) и ряд ускоренных методов.
Определение чувствительности микробов к антибиотикам in vitro проводится в условиях, значительно отличающихся от тех, в которых препарат действует в организме. На его результаты большое воздействие оказывают такие факторы, как состав и рН питательной среды, величина посевной дозы, возраст культуры, условия культивирования и др. При использовании метода диффузии в агар на результаты исследований влияют толщина слоя питательной среды, ее влажность, скорость диффузии антибиотиков, скорость роста исследуемых микроорганизмов и др. Метод диффузий в агар (метод бумажных дисков) наиболее прост и широко используется, однако является лишь качественным. Метод последовательных разведений антибиотика в питательной среде в стандартных условиях опыта является более надежным и точным количественным методом.
Восприимчивыми бактериями являются те, которые относятся к наиболее восприимчивой подгруппе населения и не обладают механизмами резистентности. Некоторые органы делят полностью восприимчивые бактерии от пограничных восприимчивых бактерий, которые, хотя и обладают механизмом резистентности к низким уровням, обычно реагируют на стандартные терапевтические режимы.
Размышления клинициста об устойчивости микробов к антибиотикам, и не только о ней
Многие другие факторы, влияющие на ответ на терапию, часто затрудняют определение клинического эффекта только химиотерапии. Бактерии с низкоуровневыми микробиологическими резистентными механизмами могут быть клинически восприимчивыми, хотя иногда их называют пограничными.
Метод серийных разведений
Показанием к определению чувствительности методом серийных разведений является необходимость получения количественных данных (преимущественно при тяжелом течении процессов) для проведения регулируемой антибиотикотерапии (разработка режимов введения).
Установление степени чувствительности к ряду антибактериальных препаратов микроба, вызывающего инфекционный процесс, влияет на выбор антибиотика (отказ от препаратов, характеризующихся относительно высокой токсичностью при умеренной чувствительности к ним возбудителя), его дозировку (концентрация антибиотика в крови в 2 — 3 раза должна превышать его МПК в отношении возбудителя) и режим введения. Количественное определение чувствительности необходимо также для определения бактерицидности избранного препарата (как гарантии быстрого терапевтического эффекта и безрецидивного течения) в отношении данного возбудителя.
Микробиологически устойчивыми организмами являются те, которые обладают любым механизмом сопротивления. Этот термин может быть квалифицирован как «умеренно или очень устойчиво» или «низкоуровневое или высокоуровневое сопротивление». Клиническая резистентность возникает, когда инфекция очень маловероятна для ответа даже на максимальные дозы данного антибиотика.
Бактерия классифицируется как промежуточная восприимчивость, если она относится к группе штаммов, которая находится между клинически восприимчивой и клинически устойчивой. Инфекции, вызванные такими штаммами, имеют переменные ответы на химиотерапию, но могут быть устранены, если антибиотик концентрируется в месте заражения или увеличивается дозировка.
Существуют две модификации метода — определение чувствительного микробов к антибиотикам на жидкой и на плотной питательных средах.
Метод дает возможность определить минимальную подавляющую рост концентрацию антибиотика (МПК) для выделенного штамма возбудителя. Он заключается в приготовлении ряда последовательных разведений антибиотиков в питательной среде с внесением во все разведения исследуемой культуры по подавлению роста микроба определенной концентрацией антибиотика в питательной среде судят о степени чувствительности микроорганизма.
Это полная или частичная невосприимчивость к группе антибиотиков. В строгом смысле, перекрестное сопротивление относится к антибиотикам того же химического класса. Однако механизмы сопротивления, такие как те, которые возникают в результате непроницаемости или оттока, могут влиять на более чем один химический класс: это иногда называют ассоциированным сопротивлением.
Приобретенное сопротивление может время от времени и место менять, характер восприимчивости, который первоначально определял спектр. Снижение обычно выражается как доля инокулята, которая не может воспроизводиться на субкультуре в течение этого периода.
«Рациональная антибиотикотерапия»,
С.М.Навашин, И.П.Фомина
Неудачи антибиотикотерапии могут быть обусловлены также неправильным выбором доз и методов введения препарата, поздним началом лечения, применением антибиотиков в заниженных дозах при комбинированной терапии, недостаточной продолжительностью лечения и т. д. Не всегда принимается также во внимание возможность инактивации антибиотиков ферментными системами организма, связывания белками крови и тканей, некротическими массами и др. Неудовлетворительные результаты лечения при…
Он обычно выражается в титре, который предотвращает увеличение мутности жидкой культуры при инкубации. Толерантность делает бактерицидный агент обычно бактериостатическим. Этот термин может также применяться к морфологическим или биохимическим изменениям. Безразличным эффектом комбинации антибиотиков или антибиотиков и неактивных веществ является тот, который равен эффектам отдельных веществ.
Если одно вещество более активно, чем другое, безразличие трудно отличить от аддитивного эффекта, особенно при использовании удвоения разведений антибиотика. Присадочным эффектом комбинации антибиотиков является та, в которой сумма эффектов отдельных веществ соответствует эффекту комбинации.
К ускоренным методам определения чувствительности относится метод, с помощью которого обнаруживается образование инволюционных форм бактерий под действием антибиотика при фазово-контрастной микроскопии. Инволюционные формы микроорганизмов образуются в присутствии бактериостатических концентраций антибиотика. В отсутствие его при действии суббактериостатических концентраций, а также при устойчивости изучаемого штамма к препарату вырастают нормальные микроколонии. Морфологические изменения исследуемых культур под действием антибиотика…
Отсутствие государственного регулирования применения антибактериальных средств
Синергическое действие комбинации антибиотиков или антибиотиков и неактивных веществ присутствует, если эффект комбинации превышает аддитивные эффекты отдельных компонентов. Антагонизм присутствует, если наблюдается снижение эффекта комбинации антибиотиков по сравнению с эффектом наиболее эффективного отдельного вещества.
Интерпретация изоболограммы для двух антибиотиков А и В в титровании шахматной доски. Дробная ингибирующая концентрация и фракционная бактерицидная концентрация представляют собой математические выражения влияния комбинации антибактериальных агентов. Для двух антибиотиков А и В, действующих отдельно и в комбинации.
В случае чувствительности к действию антибиотика штамма возбудителя не происходит сбраживания глюкозы при культивировании на среде, содержащей глюкозу, феноловый красный (в качестве индикатора) и определенные концентрации антибиотика. При этом среда окрашивается в фиолетовый цвет вследствие ее подщелачивания. Изменение красного цвета среды на желтый свидетельствует о расщеплении глюкозы с образованием кислоты в результате роста штамма, устойчивого…
Гипотетические кривые сокращения времени для двух антибиотиков А и В, действующих только на бактериальную культуру и в комбинации, демонстрирующих синергизм. Исходным раствором антибиотика является исходный раствор, используемый для дальнейшего разведения.
Опорные штаммы каталогизированы, характеризуются бактериями со стабильными, определенными фенотипами восприимчивости к антибиотикам. Опорные штаммы хранятся в виде товарных культур, из которых производятся рабочие культуры. Они доступны из коллекций культуры и используются для контроля качества.
В Англии до настоящего времени применяют предложенный Flemming метод канавки. Для определения чувствительности микробов к антибиотикам этим методом в чашке с агаром вырезают полоску для получения канавки, а затем засевают штрихом перпендикулярно к канавке испытуемые штаммы микробов. Канавка заполняется растопленным и охлажденным до 35—60°С агаром, содержащим определенные концентрации антибиотика. Благодаря диффузии антибиотика в питательную среду…
Разведение бульона - это метод, при котором контейнеры заполняются идентичными объемами инокулированного бульона и идентичными объемами раствора антибиотика, но постепенно возрастают концентрации антибиотика и определенный инокулят. Целью этого метода является определение самой низкой концентрации, которая ингибирует рост бактерий - минимальную ингибирующую концентрацию или другие параметры. Способ разведения бульона может быть осуществлен путем макроразложения или микроразведения.
Разведение агара включает введение противомикробного агента в твердую или полутвердую агаровую среду с геометрической прогрессией концентраций и нанесением определенного определенного бактериального инокулята на поверхность. Его целью является определение наименьшей концентрации, которая уменьшает количество жизнеспособных бактерий, присутствующих более чем на 9% после определенного времени воздействия и субкультуры без антибиотиков - минимальная бактерицидная концентрация.
Отсутствие зоны задержки роста микроба вокруг диска свидетельствует о том, что испытуемый штамм нечувствителен к данному антибиотику; при зоне диаметром до 10 мм штамм расценивается как малочувствительный. Единичные колонии или тонкая пленка роста внутри зоны задержки роста не учитываются. Размер зон может меняться в зависимости от толщины слоя агара, густоты микробного газона, состава среды. Однако…
Методы определения чувствительности к антибиотикам
Диффузия антибиотика из дисков, таблеток или полосок в твердой инокулированной культуральной среде вызывает зоны ингибирования, диаметры которых коррелируют с минимальными ингибирующими концентрациями для бактерий. Среда представляет собой культуральную среду, которая может быть отверждена агаром, который используется для способов разбавления агаром или бульонами и испытания на диффузию агара.
Замена аптечными работниками антибиотиков, назначенных врачом, на более дешевые «аналоги»
Размер инокулята - это количество бактерий в суспензии, рассчитанное по отношению к конечному объему. Он выражается как колониеобразующие единицы на миллилитр. Его можно определить менее точно с точки зрения мутности или оптической плотности суспензии.
Для сокращения объема испытания следует использовать наборы дисков с учетом вида выделенного возбудителя и локализации инфекции (смотрите таблицу ниже). Основные наборы дисков с антибиотиками, рекомендуемые для определения чувствительности в зависимости от вида выделенной культуры и патологического материала Антибиотик, содержащийся в диске Предварительное испытание чувствительности микрофлоры патологического материала Испытание чувствительности чистой культуры гной моча мокрота Staphylococcus…
Зона ингибирования - это зона, свободная от роста на бактериальной лужайке, что является следствием ингибирующего действия антибиотика, который распространился в среду из его применяемого источника. Транспортные средства служат в качестве носителей для противомикробного агента для определения восприимчивости бактериального штамма, подлежащего тестированию, к соответствующим противомикробным агентам с помощью испытаний на диффузию или разбавление. Транспортные средства могут быть бумажными дисками, полосками или таблетками, загруженными определенным количеством антибиотиков и соответствующим образом помечены.
Для контроля точности и стандартности проведения исследований в каждом опыте необходимо использовать тест-культуры с известной чувствительностью к антибиотикам. ВОЗ рекомендует для этой цели три культуры Американской коллекции типовых культур: Escherichia coli (АТСС 25922), Staphylococcus aureus (АТСС 25923), Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853). При определении чувствительности выделенных возбудителей необходимо проводить контрольный анализ с измерением зон задержки роста…
В прошлом использовались другие транспортные средства, такие как колодцы или баллоны. Допуск представляет собой диапазон нагрузки на антибиотик, разрешенный производителю вокруг указанного количества в транспортном средстве: это не имеет отношения к допуску, как определено в 7 выше. Дата истечения срока действия указывается для каждой партии загруженных транспортных средств. Это указывает на то, что до указанной даты не уменьшается активность до ≤90% от заявленной активности в определенных условиях хранения.
Дата истечения срока определяется после тестирования стабильности. Хотя некоторые люди подвергаются большему риску, чем другие, никто не может полностью избежать риска заражения антибиотиками. Инфекции с устойчивыми организмами трудно поддаются лечению, требуя дорогостоящих, а иногда и токсичных альтернатив.
Приготовление чашек Расплавленную агаризованную среду (бульон на переваре Хоттингера с содержанием 120—140 мг% аминного азота — 1000 мл; агар-агар «тафуинский» —15 г, натрия фосфат двузамещенный — 3 г, рН после стерилизации 7,0—7,2) разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности. Перед заражением поверхность застывшей среды подсушивают в течение…
Источники распространения резистентных штаммов бактерий
Бактерии неизбежно найдут способы противостоять антибиотикам, разработанным людьми, поэтому сейчас необходимы агрессивные действия, чтобы сохранить новое сопротивление от развития и предотвратить сопротивление, которое уже существует в результате распространения.
Объяснение бактерий и других микробов
Микробы - это организмы, слишком маленькие, чтобы глаза могли видеть и встречаться повсюду на Земле. Существует много типов микробов: бактерии, вирусы, грибы и паразиты. В то время как большинство микробов являются безвредными и даже полезными для живых организмов, некоторые могут вызывать заболевания среди людей, других животных и растений. Эти болезнетворные микробы называются патогенами; иногда их называют «микробами» или «клопами». Все типы микробов обладают способностью вызывать устойчивость к препаратам, созданным для их уничтожения, становясь лекарственно-устойчивыми организмами.
Из двух способов определения чувствительности микробов к антибиотикам (в жидкой и плотной среде) более точным является метод серий разведений в жидкой среде. Результаты, полученные при определении чувствительности в твердой питательной среде, менее постоянны. Метод разведений в агаре не следует применять для оценки чувствительности микробов, дающих тонкий, разреженный рост (стрептококки, пневмококки) или широко распространяющихся по поверхности…
Сопротивление в Соединенных Штатах
Простое использование антибиотиков создает сопротивление. Эти препараты следует использовать только для лечения инфекций. Антибиотики относятся к числу наиболее часто назначаемых препаратов, используемых в медицине человека, и могут быть спасающими жизнь лекарствами. Тем не менее, до 50% времени антибиотики не назначаются оптимально, часто это делается, когда это не нужно, неправильное дозирование или продолжительность. Зародыши, которые загрязняют пищу, могут стать устойчивыми из-за использования антибиотиков у людей и у пищевых животных. Из-за связи между использованием антибиотиков у животных, производящих пищевые продукты, и наличием антибиотикорезистентных инфекций у людей, антибиотики, которые являются важными для лечения инфекций у людей, должны использоваться в пищевых продуктах только под контролем ветеринарии и только для управления и лечить инфекционные заболевания, а не способствовать росту. Другим важным фактором роста устойчивости к антибиотикам является распространение устойчивых штаммов бактерий от человека к человеку или от нечеловеческих источников в окружающей среде. 
Четыре основных действия по борьбе с сопротивлением
Люди разработали противомикробные препараты для уничтожения болезнетворных микробов.
В зависимости от величины посевной дозы значение МПК антибиотика может колебаться: при увеличении дозы чувствительность снижается за счет возрастания количества образуемой стафилококками пенициллиназы в среде. Пробирки инкубируют при 37° С в течение 18—24 ч. Результаты учитывают, определяя наличие или отсутствие роста микроба в среде, содержащей различные разведения антибиотика. Последняя пробирка с задержкой роста (прозрачный бульон)…
Некоторые возбудители инфекционных заболеваний со временем открытия антибиотиков мало изменили характер первоначальной чувствительности к этим препаратам (стрептококки группы А, пневмококки, менингококки, бруцеллы, некоторые сальмонеллы).
Вместе с тем, большинство патогенных микробов со временем приобрело устойчивость к широко, подчас неконтролируемо и необоснованно применяемым противомикробным средствам. Наибольшее значение проблема устойчивости микроорганизмов имеет в отношении стафилококков, шигелл, эшерихий, протея, среди которых антибиотикоустойчивые штаммы выделяются с наибольшей частотой.
По степени чувствительности к основным антибиотикам микробы подразделяются на чувствительные, умеренно чувствительные и устойчивые. В группу чувствительных входит большинство штаммов микроорганизмов, рост которых на питательных средах прекращается при использовании концентраций, соответствующих средним терапевтическим дозам антибиотиков. Если он угнетается при применении только максимальных доз препаратов, то такие микроорганизмы умеренно чувствительны к антибиотику. Если подавление роста достигается в опыте в лаборатории лишь при очень высоких концентрациях препарата, которые нельзя создать в организме, то такие возбудители инфекции относятся к устойчивым к антибиотику.
Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существует ряд методов: метод последовательных разведений в жидкой питательной среде или питательном агаре, метод диффузии в агар (метод дисков, насыщенных антибиотиками) и ускоренные методы. Метод дисков прост, широко используется, но дает лишь качественный ответ. Более надежным и точным количественным методом является метод последовательных разведений антибиотиков в питательной среде в стандартных условиях опыта. В большинстве случаев корреляция данных лабораторных исследований с клиническими бывает достаточно полной, а терапия - эффективной при изучении в динамике не только клинического течения процесса, но и возможной смены возбудителя или его чувствительности к антибиотикам.
Концентрация антибиотиков в тканях и жидкостях организма, как и их антимикробная активность, относятся к основным параметрам, определяющим эффективность антибиотикотерапии. При ее изучении наиболее широко применяют микробиологические методы исследования, основанные на способности антибиотика задерживать рост тест-микроба.
Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют:
Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков).
Метод дисков - качественный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.
Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов.
Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.
Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией.
На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.
Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10 6 -10 7 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.
Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.
К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата.Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.
Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом - исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина - Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18-20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024х0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.
Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).